PCR-tehnoloogial peavad olema kunstlikult sünteesitud mõistlikud praimerid ja ekstraheeritud proovi-DNA ning seejärel automaatne termiline tsükkel ja lõpuks toote tuvastamine ja analüüs. Praegu saab praimerite kavandamist ja sünteesi teostada vaid mõnes tugeva tehnilise tugevusega uurimisinstituudis, instituudis ja kliinikus. Rakendus peab töö alustamiseks ostma vaid PCR-tuvastuskomplekti. PCR-i automaatsel termotsüklil on palju mõjutegureid. Erinevate DNA proovide puhul on PCR reaktsioonis lisatud erinevate komponentide kogus ja temperatuuritsükli parameetrid ebaühtlased.
Järgnevalt tutvustatakse mitmeid peamisi mõjutegureid.
Üks, temperatuuritsükli parameetrid
PCR automaatses termilises tsüklis on kõige kriitilisem tegur denatureerimise ja lõõmutamise temperatuur. Nagu on näidatud operatsiooni näites, on denatureerimise, lõõmutamise ja pikendamise tingimused: 94℃60s, 37℃60s, 72℃120s, kokku 25℃30 A tsükkel, amplifitseeritud fragment on 500bp. Siin tuleks iga etapi aeg arvutada pärast seda, kui reaktsioonisegu on saavutanud vajaliku temperatuuri. Automaatses termotsükleris kulub aeg segu algsest temperatuurist nõutava temperatuurini 30-60 s. Selle viivitusaja pikkus sõltub mitmest tegurist, sealhulgas reaktsioonitoru tüübist, seina paksusest, reaktsioonisegu mahust, soojusest. allikas (veevann või kütteplokk) ja kahe etapi vaheline temperatuuride erinevus, mis tuleks termilise tsükli seadistamisel piisavalt ette näha. Pöörake tähelepanu ja arvestage sellega ning tegelik mõõtmine tuleks läbi viia iga instrumendi puhul.
Teine oluline termilise tsükli aja aspekt on kahe praimeri vaheline kaugus; mida kaugem on vahemaa, seda kauem kulub sihtjada täispikkuses sünteesimiseks. Eespool toodud reaktsiooniaeg põhineb optimaalsel sünteesi pikkusel 500 bp. Koostatakse sihtjärjestus. Siin on sissejuhatus erinevate temperatuuride valikusse.
1. Matriitsi denatureerimistemperatuur Denatureerimistemperatuur määrab temperatuuri, mille juures kaheahelaline DNA PCR reaktsioonis sulab. Kui denatureerimistemperatuuri ei saavutata, siis üheahelalist DNA matriitsi ei toodeta ja PCR ei käivitu. Madal denaturatsioonitemperatuur tähendab mittetäielikku denaturatsiooni, DNA kaheahelaline See renatureerub kiiresti, vähendades seega saagist. Tavaliselt 90–95 ℃. Kui proov saavutab selle temperatuuri, tuleb see kiiresti jahutada anniilimistemperatuurini. DNA denatureerimine võtab aega vaid mõne sekundi ja see pole vajalik pikka aega; vastupidi, kõrgel temperatuuril peaksite endast parima andma. Taq DNA polümeraasi aktiivsuse säilitamiseks lühendage seda. Maksimaalne denaturatsioonitemperatuur pärast Taq DNA polümeraasi lisamist ei tohi ületada 95 °C.
2. Praimeri anniilimistemperatuur Anniilimistemperatuur määrab PCR spetsiifilisuse ja saagise; kui temperatuur on kõrge, on spetsiifilisus tugev, kuid kui temperatuur on liiga kõrge, ei saa praimerit matriitsiga kindlalt ühendada ja DNA amplifikatsiooni efektiivsus väheneb; temperatuur on madal, saagis on kõrge, kuid liiga madal võib põhjustada praimeri ja malli mittevastavust, mittespetsiifilised tooted suurenevad. Üldiselt alustage reaktsioonitingimustest 37 ℃, seadistage kontrollreaktsioonide seeria, et määrata konkreetse reaktsiooni jaoks optimaalne anniilimistemperatuur. Testi mõistmiseks võib järeldada ka praimerite (G+C)% sisalduse põhjal. Üldtesti lähtepunkt, lõõmutamistemperatuur Ta (anniilimistemperatuur) on 5 ℃ madalam kui sulamistemperatuur. Amplifikatsioonipraimeri TTm (sulamistemperatuur), mida saab arvutada järgmise valemi järgi:
Ta = Tm-5 ℃ = 4(G{{2}}C){{4}} 2(A+T) -5 ℃
Nende hulgas tähistavad A, T, G ja C vastavalt vastavate aluste arvu. Näiteks 20-aluselise praimeri puhul, kui (G+C)% sisaldus on 50%, saab Ta lähtepunktiks seada 55 °C. Tüüpilise praimeri kontsentratsiooni korral (näiteks 0,2 μmol/L) saab anniilimisreaktsiooni lõpule viia mõne sekundiga ja pikaajaline lõõmutamine pole vajalik.
3. Praimeri pikendamise temperatuuri valik sõltub Taq DNA polümeraasi optimaalsest temperatuurist. Tavaliselt 70–75 ℃, ensüümi katalüüsitud nukleotiidide standardkiirus temperatuuril 72 ℃ võib ulatuda 35–100 nukleotiidini sekundis. minutis. 1 kb pikkust saab pikendada ja selle kiirus sõltub puhverlahuse koostisest, pH väärtusest, soola kontsentratsioonist ja DNA matriitsi olemusest. Kui amplifitseeritud fragment on lühem kui 150 aluspaari, võib pikendamise etapi ära jätta ja sellest saab kahe temperatuuri tsükkel Taq DNA tõttu. Polümeraas on piisav lühikeste järjestuste sünteesi lõpetamiseks anniilimistemperatuuril. Lühikeste järjestuste fragmentide puhul vahemikus 100 kuni 300 aluspaari on tõhus kasutada kiiret ja lihtsat kahetemperatuurilist tsüklit. Praegu on praimeri pikendamise temperatuur sama, mis anniilimistemperatuur. Üle 1 kb suuruste DNA fragmentide puhul saab pikendusaega reguleerida 1 kuni 7 minuti jooksul vastavalt fragmendi pikkusele. Samal ajal tuleks PCR puhvrisse lisada želatiini või BSA reaktiivi, et Taq DNA polümeraas püsiks aktiivne ja stabiilne pikka aega. Seks; 15%-20% glütserool aitab amplifitseerida umbes 2,5 kb või pikemaid DNA fragmente.
4. Tavalise PCR tsüklite arv on üldiselt 25 kuni 40 tsüklit. Üldine viga on see, et tsüklite arv on liiga palju, mittespetsiifiline taust on tõsine ja keerukus suureneb. Muidugi on reaktsioonitsüklite arv liiga väike ja saagis madal. Seetõttu on vaja tagada toote saamine. Kiiruse eeldusel tuleks tsüklite arvu minimeerida.
Pärast amplifikatsiooni lõppu proov jahutatakse ja säilitatakse temperatuuril 4 °C.
2. Primer Primer Design
Matriitsi DNA amplifitseerimiseks peate esmalt kavandama kaks oligonukleotiidpraimerit. Niinimetatud praimerid on tegelikult kaks oligonukleotiidi fragmenti, mis on komplementaarsed amplifitseeritava sihtmärk-DNA järjestusega. Kahe praimeri vaheline kaugus määrab amplifitseeritud fragmendi pikkuse. , Kahe praimeri 5'otsad määravad amplifitseeritud produkti kahe 5'otsa asukoha. On näha, et praimerid on võtmeks PCR-iga amplifitseeritud fragmentide pikkuse, asukoha ja tulemuste määramisel ning praimeri disain on olulisem.
Praimeri kavandamise vajalik tingimus on, et praimeriga komplementaarne sihtmärk-DNA järjestus peab olema teada. Kahe praimeri vaheline järjestus ei pruugi olla selge. Kaks teadaolevat järjestust on üldiselt 15-20-aluselised, mida saab sünteesida DNA süntesaatoriga. Lisaks on praimerite kujundamisel üldiselt järgitavad põhimõtted, mis vastavad kahele täiendavale praimerile:
1. Praimeri pikkus arvutatakse statistika järgi ja tõenäosus, et inimese genoomis võib ilmuda umbes 17-aluseline oligonukleotiidjärjestus, on üks kord. Seetõttu on praimeri pikkus üldiselt vähemalt 16 nukleotiidi ja suurim mitte rohkem kui 30 nukleotiidi ning parim pikkus on 20–24 nukleotiidi. Sellised lühikesed oligonukleotiidid ei moodusta polümerisatsioonitemperatuuril (üle 72 °C) stabiilset hübriidi. Mõnikord võib see olla 5' Geeni kloonimise ja muude erivajaduste lõpuleviimiseks lisage järjestused, mis ei ole matriitsiga komplementaarsed, nagu näiteks restriktsiooniensüümi saidid või promootorid; praimeri 5'otsa biotiini märgist või fluorestseeruvat märgist saab kasutada erinevatel eesmärkidel, näiteks mikroobide tuvastamiseks.
Mõnikord ei tööta praimer' põhjus on teadmata, selle lahendamiseks võite positsiooni liigutada.
2. (G+C)% sisaldusega praimerite koostis peaks olema ühtlane ja proovige vältida sama aluspolümeeri sisaldamist. (G+C)% sisaldus kahes praimeris peaks olema võimalikult sarnane, teadaolevas amplifitseeritud fragmendis (G+C) % sisaldus peaks olema amplifitseeritava fragmendi lähedane, üldiselt 40% kuni 60% on parem.
3. Krundi sisemus peaks vältima ilmsete sekundaarsete struktuuride, eriti juuksenõelastruktuuride teket. Näiteks:
4. Praimerite vahel ei tohiks olla komplementatsiooni kahe praimeri vahel, eriti praimeri 3'otsas. Isegi kui seda ei saa vältida, ei tohiks 3'otsa komplementaarne alus olla suurem kui 2 alust, vastasel juhul on lihtne moodustada"praimeri dimeer" Või"Praimeri dimeer" (Praimeri dimeer). Niinimetatud praimeri dimeer on sisuliselt kaheahelaline DNA fragment, mis moodustub ühe praimeri pikenemisel teisele praimeri järjestusele DNA polümeraasi toimel. , on PCR-i tavaline kõrvalsaadus ja muutub mõnikord isegi põhitooteks.
Lisaks vältige homoloogseid järjestusi kahe praimeri vahel, eriti oligonukleotiidfragmente, millel on rohkem kui 6 järjestikust identset alust, vastasel juhul konkureerivad kaks praimerit üksteisega matriitsi sama saidi pärast; samamoodi ei saa amplifitseeritavatel praimeritel ja sihtmärk-DNA-l või proovi DNA teistel järjestustel olla homoloogseid järjestusi, mis koosnevad üle 6-aluselisest. Vastasel juhul seonduvad praimerid teiste saitidega, vähendades spetsiifilist amplifikatsiooni ja suurendades mittespetsiifilist amplifikatsiooni.
5. Praimer 3'otsa siduv DNA polümeraas lisab ühe nukleotiidi praimeri 3'otsa. Seetõttu peavad praimeri 3'otsa 5-6 aluse ja sihtmärk-DNA sidumisnõuded olema täpsed ja ranged, et tagada efektiivne PCR amplifikatsioon. .
Kas praimeri disain on mõistlik, saab kontrollida arvutiotsinguga PCRDESN tarkvara ja Ameerika PRIMER tarkvara abil.
Kunstlikult sünteesitud oligonukleotiide tuleks eelistatavalt puhastada kromatograafia (kromatograafia) või PAGE abil, et eemaldada lisandid, nagu lühikesed ahelad, mida pole täispikkuses sünteesitud. Puhastatud praimerid, mida hoitakse 25% atsetonitriili lahuses temperatuuril 4°C, võivad takistada mikroorganisme. Tavaolukorras tuleb kasutamata praimereid hoida külmkapis temperatuuril -20°C. Praimereid võib vedelikus säilitada 6 kuud ja pärast lüofiliseerimist 1–2 aastat.