Epideemiajärgsel ajastul on mõiste "nukleiinhapete testimine" meile kõigile tuttav ja sellest on saanud meie igapäevaelu osa.
Niisiis, kas teate, kuidas nukleiinhapete testimine viiruseid tuvastab? Ja kuidas muudab nukleiinhapete testimine nähtamatud viirused "nähtavaks"?
01 Mis on nukleiinhape
Nukleiinhape on DNA ja RNA üldnimetus.
Nukleiinhape on kogu teadaoleva maa elu oluline komponent. DNA, mida me sageli ütleme, on desoksüribonukleiinhape. Uue koronaviiruse geneetiline materjal on RNA - ribonukleiinhape.
Nukleiinhapete amplifikatsiooni testimine
02 Mida nukleiinhapete testimine täpselt tuvastab?
Nukleiinhapete tuvastamise aine on viiruse nukleiinhape.
Uus koroonaviirus on viirus, mis sisaldab ainult RNA-d ja spetsiifiline RNA järjestus viiruses on marker, mis eristab viirust teistest patogeenidest. Nukleiinhapete tuvastamise eesmärk on välja selgitada, kas patsiendi hingamisteede proovis või veres on võõra sissetunginud viiruse nukleiinhapet, et teha kindlaks, kas ta on nakatunud uue koroonaviirusega. Valdav enamus praegusest uue koroonaviiruse nukleiinhapete tuvastamisest kasutab fluorestseeruvat kvantitatiivset PCR meetodit, et amplifitseerida viiruse RNA sihtjärjestus PCR abil pärast pöördtranskriptsiooni.
PCR ehk polümeraasi ahelreaktsioon on molekulaarbioloogia meetod, mida kasutatakse spetsiifiliste DNA fragmentide amplifitseerimiseks; see viitab spetsiifiliste geenide DNA polümeraasi katalüüsitud reaktsioonile või DNA järjestuste kiire in vitro amplifikatsiooni reaktsiooni nimetatakse ka geenide in vitro amplifikatsiooniks. Fluorestseeruva kvantitatiivse PCR-tehnoloogia eesmärk on lisada PCR reaktsioonisüsteemi fluorestseeruv reportersüsteem ja kasutada fluorestsentssignaali muutust PCR-i protsessi reaalajas jälgimiseks, et teostada esialgse malli kvantitatiivne tuvastamine.
Nukleiinhappe tuvastamiseks tuleb kõigepealt koguda proov. Praegu on kõige tavapärasem proovivõtumeetod: ülemiste hingamisteede (neelu või ninaõõne) pühkimiseks ja kogumiseks kasutage kõri või nina tampooni; kogutud proovid suletakse rangelt ja saadetakse seejärel laborisse järkjärguliseks testimiseks.
1. Viiruse RNA ekstraheerimine
Esmalt ekstraheeritakse proovist viiruse RNA. Viiruse hävitamiseks ja nukleiinhappe vabastamiseks lisage proovile nukleiinhappe ekstraktsioonireagendid.
2. Viiruse RNA "pöördtranskriptsioon" cDNA-ks
Pöördtranskriptsioonitehnoloogia (RT) abil "pööratakse" viiruse RNA spetsiifiliseks DNA-ks, mida on mugavam tuvastada, see tähendab cDNA-ks.
3. cDNA amplifikatsioon ja tuvastamine
Tegelikult, olgu selleks kõri, nina tampooni või isegi vereproovide võtmine, on viiruse sisaldus proovis suhteliselt madal, isegi raskelt nakatunud patsientidel (viiruskoormus on suur); kuna viiruseosakesed on liiga väikesed ja proovivõtu maht piiratud, Proovis sisalduvate viiruste arv on nukleiinhapete tuvastamiseks endiselt liiga väike.
Seetõttu võimendavad inspektorid PCR-tehnoloogia abil proovis oleva uue koroonaviiruse unikaalset "parooli" nii kaugele, et seadmed suudavad selle tuvastada, et hinnata, kas tegemist on positiivse infektsiooniga. Kogu viiruse geneetilise materjali haaramise protsess on nagu kalapüük. Konks tuvastab ja haarab selle, nii et viirusel pole kuhugi peita.
Lihtsamalt öeldes on see cDNA arvu võimendamine, nii et cDNA-d replitseeritakse pidevalt, nii et see arv kasvab eksponentsiaalselt.
Standardne PCR-protsess jaguneb kolmeks etapiks:
Denatureerimine: kõrge temperatuuri kasutamine DNA kaksikahelate eraldamiseks. DNA kaksikahelate vahelised vesiniksidemed katkevad kõrgel temperatuuril (93 - 98 kraadi).
Lõõmutamine: Pärast DNA kaheahelaliste ahelate eraldumist alandatakse temperatuuri, et praimerid saaksid seonduda üheahelalise DNA-ga.
Laiendamine: DNA polümeraas sünteesib temperatuuri alandamisel seotud praimerist komplementaarse ahela piki DNA ahelat. Kui pikenemine on lõppenud, lõpeb üks tsükkel ja DNA fragmentide arv kahekordistub. Korrake neid kolme sammu 25-35 korda ja DNA fragmentide arv suureneb eksponentsiaalselt.
PCR kaheahelaline matriit
Sel ajal, kui cDNA-d amplifitseeritakse, töötavad komplektis olevad fluorestseeruvad sondid samaaegselt. See vabastab fluorestsentssignaali ja iga kord, kui cDNA-d võimendatakse, suureneb fluorestsentssignaal veidi ja PCR-detektor suudab salvestada fluorestsentssignaali suurenemise Ct väärtuse.
Ct väärtus on oluline näitaja, et otsustada, kas viiruse nukleiinhape on negatiivne või positiivne. Mida vähem algset DNA-d, seda rohkem on teatud läve saavutamiseks vaja PCR tsükleid ja seda suurem on Ct väärtus. Ja vastupidi, mida rohkem algset DNA-d, seda madalam on Ct väärtus. Algne DNA kogus peegeldab viiruse RNA kogust proovis, mis omakorda peegeldab viiruse hulka proovis. Seega, kui Ct väärtust ei tuvastata või see on teatud väärtusest kõrgem, hinnatakse kahtlustatav patsient negatiivseks; kui see on sellest väärtusest madalam, hinnatakse kahtlustatav patsient positiivseks.
PCR-reaktsiooni ajal on PCR-i kulumaterjalide valik ka üks olulisemaid nukleiinhapete tuvastamise tulemusi mõjutavaid tegureid.