Täna räägime PCR-katsete võtmeelemendist – kulumaterjalidest. PCR-i sagedase külastajana on vaja mõista PCR-i kulumaterjalidega seotud omadusi ja terminoloogiat.
Turul on palju erinevaid PCR-i tarvikuid, sealhulgas kaubamärgid, spetsifikatsioonid, värvid jne, mis on pimestavad. Mõistame seda samm-sammult.
pcr plaat
1. Materjalid
Tavaliselt on PCR-i kulumaterjalide tooraineks polüpropüleen. See on hea kuumuskindel inertne materjal. Töötemperatuuri vahemik on -30 kuni 140 kraadi, mis võimaldab tal taluda soojusenergia muutusi PCR reaktsiooni termilise tsükli ajal ning mängib head rolli PCR reaktsioonisüsteemis olevate ainete sulgemisel ja kaitsmisel.
Lisateavet polüpropüleeni kohta
2. Värv
Levinud on valged torud ja läbipaistvad PCR-tuubid. Traditsioonilistes PCR-katsetes pole nende kahe vahel erinevust. Samas reaalajas / qPCR-i katses olid valged torud suhteliselt tundlikumad ja järjepidevamad apikaalsete signaalide lugemisega qPCR-instrumentide jaoks (vt jooniseid A ja B allpool). miks see nii on?
pcr toru
A: valgete torude madalamad Ct väärtused võrreldes läbipaistvate torudega; B: parem korratavus valgete torudega.
qPCR-i põhiandmed on Ct väärtus ja fluorestsentssignaal on andmeallikas Ct väärtuse arvutamisel, seega on väga oluline, kas fluorestsentsi torus saab täielikult detektorisse edastada. Valge toru sein ei lase fluorestsentsil läbi toru seina läbida ja murduda (joonis A allpool), takistades sellega fluorestsentsi ülekandumist kütteplokile (st selle metallava seinale, kuhu toru asetatakse) ja neeldumist. või ploki poolt ebajärjekindlalt kajastatud. Valge toru otsast koguti tugevam ja kontsentreeritum fluorestsentssignaal võrreldes läbipaistva toruga (joonis B allpool).
pcr toru
V: fluorestsentssignaali muutuv trend läbipaistvas torus ja valges torus; B: fluorestsentsi intensiivsuse võrdlus pärast sama koguse fluorestseiini lisamist.
Nii et kui kasutate kõrgeima lugemisvõimega qPCR-i instrumenti, proovige valgeid torusid.
3. Kvaliteet (kas või mitte lahja)
Siin rõhutatakse kulumaterjali kvaliteedi tähtsust. qPCR tarbekaubad peavad olema saasteainete ja inhibiitorite vabad. Kõrge rõhk ja kiirgus eemaldavad bakterid ja DNaasid, kuid mitte tolmu ja DNA jääke, mis võivad pärssida PCR reaktsioone või põhjustada mittespetsiifilist amplifikatsiooni. Ainetel on neeldumine ja isegi väikesed saasteained neelavad reaktsioonisüsteemi fluorestsentsi ja mõjutavad fluorestsentssignaalide kogumist. Lisandite saastumise mõju katsele demonstreerimiseks kasutati katse liialdatud versiooni. Nagu on näidatud alloleval joonisel, lisati oktaavi ühte reaktsioonisüvendisse lisand. Nagu oodatud, näitasid amplifikatsioonikõverad märkimisväärseid kõrvalekaldeid.
Lisandid PCR reaktsioonitorudes
↑ Lisandid reaktsioonitorus
8 riba
↑ Korduvad reaktsioonitulemused 8 katseklaasi puhul, vasakpoolse süvendi lisand "hälbib" kõverat.
Meeldetuletus: Olge ettevaatlik, et tarbekaubad ei puutuks pikka aega õhu kätte. Pärast kulumaterjalide väljavõtmist sulgege pakendikott kiiresti, et vältida selle paljaste kätega puudutamist. Võimalusel töötage puhtal pingil.
4. Mahutavus / suurus / voog
Maht määrab, kui palju proovi (reaktsioonimahtu) saab laadida. Üleannustamine võib põhjustada soojusülekande efektiivsuse vähenemist, mahavalgumist või ristsaastumist; aladoseerimine võib põhjustada aurustumise proovi kadu. QPCR-instrumendi kuumutusplokk määrab ka kasutatavad kulumaterjalid ja reaktsioonisüsteemi suuruse. Läbilaskevõimet on lihtne mõista, see on maksimaalne proovide arv, mida saab ühes katses laadida. Üldised võimsuse ja voo spetsifikatsioonid on näidatud allolevas tabelis:
Üks tuub/kaheksa rida {{0}},2 ml, 0,1 ml
{{0}}kaevuplaat 0,2 ml, 0,1 ml
{{0}}süvendplaat 0,2 ml
Ka võimsuse spetsifikatsioonid jagunevad üldiselt standardseteks ja madalateks tüüpideks, nagu allpool näidatud. Madala profiiliga kulumaterjalidel on madalam kõrgus. See lühike konstruktsioon minimeerib reaktsioonisüsteemi kohal olevat ruumi ("surnud maht" - kasutu osa), vähendab termilise tsükli ajal tekkivat aurustumise mõju ja võimaldab küttemoodulil selle ümber suuremal määral mähkida, et parandada soojusülekande efektiivsust. Seetõttu nimetatakse madala profiiliga torusid ka "kiireteks" torudeks või plaatideks.
pcr toru
Meeldetuletus: tavaliselt kasutatav reaktsioonimaht on 20 µL ja soovitatav on kasutada väikesemahulist 0,1 ml või väikese mahuga reaktsioonituubi.
5. Seina paksus
Toruseina paksus mõjutab otseselt soojusjuhtivust. PCR-i kulumaterjalide seinapaksus peab olema ühtlane, et tagada ühtlane soojusülekanne. Üliõhuke torusein on standardversioonist 50 protsenti õhem, mis vähendab veelgi soojusbarjääri ning toob kaasa kiiremad ja paremad reaktsiooniefektid. Seetõttu on PCR-reaktsioonide efektiivsuse maksimeerimiseks ning stabiilsete ja tõhusate reaktsioonide tagamiseks parim valik ühtlased ja üliõhukesed PCR-i kulumaterjalid.
6. Läbipaistvus
QPCR-i korgid ja tihenduskiled nõuavad suurt optilist selgust, et tagada fluorestseeruvate signaalide optimaalne läbitungimine ja edastamine, vähendades samal ajal moonutusi (ülalt loetavate qPCR-seadmete puhul). Mida suurem on toru seina läbipaistvus, võib see mõjutada katsetulemusi. Põhjust on selgitatud eespool. Traditsiooniline PCR võib seda funktsiooni ignoreerida.
7. Seelikud
PCR-plaadi ääris viitab plaadi perifeersele pikendusele. Reaktsioonisüsteemide ehitamisel toimib seelik pipeteerimisprotsesside stabiilse toena ning tagab mehaanilise tugevuse ja haarde, kui see on kombineeritud automatiseeritud tööjaamadega. Levinud on kolm tüüpi seelikuid, poolseelikud ja täisseelikud (vastavad A, B ja C alloleval joonisel).
Seelikuta: saab kasutada enamiku PCR- või qPCR-seadmetega, kuid mitte automatiseeritud rakenduste jaoks. Pipeteerimise ajal kergesti liigutatav, mitte väga stabiilne, tuleb kasutada plaadihoidjaga.
Poolseelikud: Ideaalne automatiseeritud rakenduste jaoks, millel on hea pipeteerimise stabiilsus.
Täielik seelikuplaat: Ideaalne automatiseeritud rakenduste jaoks. Hea mehaaniline tugevus, sobib väljaulatuvate moodulitega PCR-instrumentidele, kõrge stabiilsus pipeteerimise ajal.
pcr plaat
Näpunäited: seeliku tähtsus on pigem industrialiseerimise ja automatiseeritud partiitöötluse hõlbustamine koos robotkäega. Seda ei pruugi traditsioonilistes uurimislaborites vaja minna, ühestki seelikust ei piisa.
pcr plaat
8. Parafilm
PCR-plaadi tihenduskile on valmistatud läbipaistvast plastikust või alumiiniumfooliumist. Levinud on kleepuvad läbipaistvad kiled, mis sobivad 96 või 384 süvendiga plaatidele ja peaksid olema piisavalt hea valguse läbilaskvusega. Kile tihendamisel surutakse väikese kaardiga kile ümber tihendusava, et vältida õhulekkeid.
Kleepuvad alumiiniumkiled võivad olla vähem levinud. Kuigi see ei sobi qPCR-i jaoks, on see ideaalne kulumaterjal valgustundlike proovide jaoks. Kuna seda saab mulgustada, hõlbustab see proovi ülekandmist PCR-is (tavalise PCR jaoks).
PCR-plaadi tihenduskile
Tehke kokkuvõte
PCR-süsteemi kandjana on tarbekaubad katseandmete kvaliteedi parandamiseks väga olulised. Loodan, et see jagamine aitab teil mõista mõningaid näpunäiteid PCR-i kulumaterjalide kohta ja pakkuda abi kulumaterjalide paremaks valimiseks.