Ebanormaalsete rakukultuuride levinumad põhjused

Rakukultuuri protsessis esineb sageli üht või teist laadi probleeme. Ärge alahinnake rakukultuuri, kuid see sisaldab ülikooli küsimusi. Kasutajatega suheldes leiate palju probleeme, mida saab vältida. Järgmised on rakukultuuri protsessis tavalised. Analüüsige kõrvalekalde põhjust.

petri tassis

1. Kultiveeritud rakud ei kleepu seina külge

võimalik põhjus

1. Trüpsiini liigne seedimine;

2. Mükoplasma saastumine;

3. Söötme pH väärtus on liiga aluseline (NaHCO3 lagunemine);

4. Rakkude vananemine;

5. Inokuleeritud rakkude esialgne kontsentratsioon on liiga madal või liiga kõrge.

Lahendus

1. Lühendage trüpsiini seedimise aega või vähendage trüpsiini kontsentratsiooni;

2. Eraldage kultuur ja tuvastage mükoplasma. Puhastage alus või inkubaator. Kui avastatakse mükoplasma saastumine, visake kultuur minema;

3. Kasutage pH reguleerimiseks või steriilse CO2-ga täitmiseks steriilset äädikhappelahust;

4. Lubage uued kaitserakud;

5. Reguleerige inokuleeritud raku optimaalne kontsentratsioon.

2. Suspensioonirakkude rühmitamine

võimalik põhjus

1. Kultuurisööde sisaldab kaltsiumi ja magneesiumi ioone;

2. Mükoplasma saastumine;

3. Proteaasi liigne seedimine põhjustab rakkude lüüsi;

4. DNA saastumine.

Lahendus

1. Peske rakke kaltsiumi- ja magneesiumivaba tasakaalustatud soolalahusega ning puhuge ja imege õrnalt

2. Rakud saavad ühe raku suspensiooni;

3. Eraldage kultuur ja tuvastage mükoplasma;

4. Rakkude töötlemine DNA-ga.

3. Kultiveeritud rakud kasvavad aeglaselt

võimalik põhjus

1. Erineva söötme või seerumi asendamise tõttu;

2. Mõned rakkude kasvuks vajalikud komponendid söötmes, nagu glutamiin või kasvufaktorid, on ammendunud või puuduvad või on hävinud;

3. Kultuuris on väike kogus bakteriaalset või seeninfektsiooni;

4. Reaktiivide ebaõige ladustamine;

5. Inokuleeritud rakkude algkontsentratsioon on liiga madal;

6. Rakud on vananenud;

7. Mükoplasma saastumine.

Lahendus

1. Võrrelge uue söötme ja algse söötme koostist, võrrelge uut seerumit ja vana seerumit, et toetada rakkude kasvukatseid, ning laske rakkudel järk-järgult uue söötmega kohaneda;

2. Vahetage värskelt valmistatud söötme vastu või lisage glutamiini ja kasvufaktoreid;

3. Kasutage kultiveerimiseks antibiootikumivaba söödet, saastumise korral visake kultuur minema;

4. Seerumit tuleks hoida temperatuuril -10 kuni -20 kraadi. Kultuurisöödet tuleb hoida 2-8 kraadi juures pimedas. Seerumit sisaldavat täiskultuuri söödet tuleb hoida temperatuuril 2-8 kraadi ja see tuleb ära kasutada 1 nädala jooksul;

5. Suurendage inokuleeritud rakkude algkontsentratsiooni;

6. Muuda uuele kaitselahtrile;

7. Eraldage kultuur ja tuvastage mükoplasma. Puhastage alus ja inkubaator. Kui avastatakse mükoplasma saastumine, visake kultuur ära.

Neljandaks kasvavad kultiveeritud rakud halvasti

võimalik põhjus

A. Raku enda olek

1. Rakkude läbipääsude arv on suur ja rakud vananevad;

2. Rakkude inokulatsiooni kogus: liiga väike nakatamise kogus, aeglane raku kasv;

3. Rakkude läbimine on liiga hilja: rakumürgitus, mis mõjutab rakkude kasvu pärast läbimist;

4. Trüpsiini seedimise aeg on liiga pikk või liiga lühike: kui aeg on liiga pikk, rakud surevad; kui aeg on liiga lühike, ei eraldata rakud täielikult klastriteks ja rakud surevad;

5. Rakkude külmsäilitamine ja taastamine: aeglane külmutamine ja kiire lüüs.

B. Reostus

1. Mükoplasma saastumine;

2. Hallitussaaste.

C, sööde või seerum

1. Valideerimist enne seerumi või söötme asendamist ei toimu;

2. Kas valitud meedium sobib;

3. kas söötme ettevalmistus on sobiv;

4. Kas söötme ettevalmistus on täpne.

D. keskkonda kasvatada

1. Kas CO2 tarnimine on normaalne?

2. Inkubaatori või loksuti temperatuur on korralikult kontrollitud.

Lahendus

Vastavalt ülaltoodud neljale võimalikule põhjusele tehke sihipäraseid lahendusi

1. Pöörake tähelepanu rakkude olekule: nt passaažide arv, inokulatsiooni hulk jne;

2. Väldi reostust (kasuta tavalist, legaalset ja jälgitavat seerumit);

3. Kasutage sobivat seerumit või söödet, eelistatavalt kontrollitud;

4. Pöörake tähelepanu laborikeskkonnale.

Rakusurma võimalikud põhjused kultuuris

1. Inkubaatoris ei ole CO2;

2. Inkubaatori temperatuur kõigub liiga palju;

3. Rakud on kahjustatud külmsäilitamise või taastamise käigus;

4. Kultuurisöötme osmootne rõhk on vale;

5. Toksiliste metaboliitide kuhjumine söötmes.

Lahendus

1. Tuvastage inkubaatoris CO2;

2. Kontrollige temperatuuri inkubaatoris;

3. Võtke uus säilinud rakuliik;

4. Tuvastage söötme osmootne rõhk;

5. Vahetada värske söötme vastu;