Pärast kasutamist peame PCR kaheksa toruga komplekti pesema. PCR Octal Kiti puhastamiseks on mitmeid viise. Millele peaksin selle kasutamisel tähelepanu pöörama?
Katsemeetodi põhimõte: Ränidioksiidi geelmembraan seondub DNA-ga kõrge soola tingimustes ja eraldub DNA-st madala soola tingimustes. Praimerid, mononukleotiidid, ensüümid, mineraalõli, soolaioonid jne eraldatakse DNA-d sisaldavas pesulahuses, kuna neil ei ole DNA-ga sarnaseid omadusi.
Katsematerjalid: PCR tooted, reaktiivid, komplektid, PCR puhastuskomplektid, instrumendid, tarbekaubad, 96-kaevulised DNA ettevalmistusplaadid, 96-hästi süvakaevu plaadid, 96-kaevulised V-kujulised plaadid
1. PCR kaheksa toru tootja räägib komplekti koostisest, ladustamisest ja stabiilsusest
1. Juhised, tarbekaubad: 96-kaevuline DNA ettevalmistusplaat, 96-kaevuline 1,6ml süvakaevu plaat, 96-kaevuline V-kujuline plaat.
2. Puhver PCR-A: DNA sidumise lahus. Hoidke toatemperatuuril tihedalt suletud. Sademete tekkimisel tuleb see lahustada soojas vannis temperatuuril 65 °C ja jahutada enne kasutamist toatemperatuurini.
3. Puhver W2 kontsentraat: eemaldage soolalahus. Enne kasutamist lisage pudelil määratud mahule etanool, segage hästi ja hoidke toatemperatuuril. Kasutada võib 100% etanooli või 95% absoluutset etanooli.
4. Eluent: 2,5 mM Tris-HCl, pH 8,5, hoitakse suletud olekus toatemperatuuril.
2. PCR kaheksaga ühendatud torude tootja räägib tööetappidest
Kasutajad saavad valida negatiivse rõhu või tsentrifuugimise.
A. Negatiivse rõhu meetod
1. Ühendage negatiivse rõhu seade õigesti, asetage 96-hästi DNA ettevalmistusplaat negatiivse rõhu seadmele; lisage PCR-ile 3-kordne puhver PCR-A, ensüümide seedimine, ensüümide märgistamine või sekveneerimisreaktsiooni lahus (kui puhver PCR-A on väiksem kui 100 μl, lisage 100 μl); segage hästi ja viige see 96-kaevulisele DNA ettevalmistusplaadile, lülitage sisse ja reguleerige negatiivset rõhku -25-30 tolli Hg-ni ning aspireerige aeglaselt lahus plaadil.
2. Lisage 0,3 ml puhvrit W2 ja absorbeerige lahus. Peske kaks korda 0,3 ml puhvriga W2 samal viisil.
Kinnitage absoluutse etanooli lisamine puhver W2 näidatud mahule, keskendudes reaktiivpudelile.
3. Säilitage negatiivne rõhk ja eraldage 96-kaevuline DNA ettevalmistusplaat 10 minutiks.
4. Jahvatage 96-kaevuline DNA ettevalmistusplaat 6 korda pikale kiulisele koele, kui drenaažitoru on allapoole suunatud.
5. Asetage 96-kaevuline DNA ettevalmistusplaat 96-kaevulisele V-kujulisele plaadile, lisage membraani keskele 25-30ul vett või elute ja laske seista 1 minut toatemperatuuril. DNA-d pääses tsentrifuugimine 3000 x g juures 5 minutit.
B. Tsentrifugaal
1. lisage PCR-Ile, seedimisele, ensüümide märgistamisele või sekveneerimise reaktsioonidele 3 kogust puhvrit PCR-A (kui puhver PCR-A on väiksem kui 100 μl, lisage 100 μl) puhvrit PCR-A (kui puhver PCR-A on väiksem kui 100 μl, lisage 100 μl) PCR-ile, seedimisele, ensüümide märgistamisele või sekveneerimise reaktsioonidele; segage ja siirdage 96-kaevulisele DNA-le 96-hästi ettevalmistusplaadil. Asetage DNA ettevalmistusplaat 96-kaevulisse 1,6 ml sügavusele kaevuplaadile, tsentrifuug 1000 x g juures 1 minutiks ja visake filtraat ära.
2. Lisage 96-kaevulisel DNA ettevalmistusplaadil 0,3 ml puhvrit W2, tsentrifuug 1000×g juures 1 minut ja visake filtraat ära. Peske uuesti samamoodi 0,3 ml puhvriga W2. Kinnitage absoluutse etanooli lisamine puhver W2 näidatud mahule, keskendudes reaktiivpudelile.
3. Asetage 96-kaevuline DNA ettevalmistusplaat 96-kaevulisse 1,6 ml sügavuskaevu plaadile ja tsentrifuugile 3000×g juures 10 minutiks.
4. Asetage 96-kaevuline DNA ettevalmistusplaat puhtale 96-kaevulisele V-kujulisele alumisele plaadile, lisage membraani keskele 25-30ul vett või elute ja laske seista 1 minut toatemperatuuril. DNA-d pääses tsentrifuugimine 3000 x g juures 5 minutit.
PCR kaheksanurktorude tootjad räägivad tähelepanu vajavatest küsimustest:
1. Eluendi või vee kuumutamine 65 °C-ni võib aidata parandada elutsiooni efektiivsust.
2. DNA molekulid on happelised, soovitatav on säilitada 2,5 mM Tris-HCl, pH 8,5 eluate.
