1. Taastumine
●1. Võtke krüoviaal vedelast lämmastikust välja, asetage see kohe 37-kraadisesse veevanni ja raputage kergelt. Kui vedelik on sulanud (umbes 1-1,5 minutit), võtke see välja, piserdage veidi alkoholi ja asetage see ülipuhtale töölauale.
●2. Aspireerige ülaltoodud rakususpensioon 15 ml tsentrifuugituubi, mis on täidetud 10 ml söötmega (peske külmsäilitustoru söötmega, et pesta maha kõik seinale kleepunud rakud) ja tsentrifuugige kiirusel 1000 p/min 5 minutit.
●3. Valage supernatant ära ja lisage rakkude suspendeerimiseks 1 ml keskkonda. Aspireeritakse 10 cm läbimõõduga Petri tassi, mis sisaldab 10 ml söödet, ja raputatakse õrnalt edasi-tagasi, et rakud Petri tassis ühtlaselt jaotuks.
●4. Märgistage raku tüüp ja kuupäev, kultivaatori nimi jne ning asetage see kultiveerimiseks CO2 inkubaatorisse. Pärast rakkude kleepumist seina külge vahetage söödet.
●5. Vahetage söödet iga 3 päeva järel.
2. Läbisõit
●1. Passeerimine, kui rakkude katvus kultiveerimisnõus jõuab 80 protsendini -90 protsenti.
●2. Aspireerige originaalkandjat.
●3. Lisage sobiv trüpsiin (täpselt nii palju, et katta rakud) ja seedige 1-2 minutit.
●4. Pärast rakkude ümardamist lisage seedimise lõpetamiseks võrdne kogus seerumit sisaldavat söödet.
●5. Kasutage pipetti rakkude suspendeerimiseks pipeteerimise teel.
●6. Aspireerige rakud 15 ml tsentrifuugitorusse ja tsentrifuugige 5 minutit kiirusel 1000 p/min.
●7. Valage supernatant ära, lisage 1-2ml söödet ja puhuge rakud õhku.
●8. Viige rakud olenevalt rakutüübist mitmele tassile. Üldiselt on 5 vähirakku ja 3 normaalset rakku. Jätkake kasvatamist.
3. Külmsäilitamine Seedige rakud ja tsentrifuugige (ibid.). Suspendeerige rakud valmistatud külmutuslahusega ja jagage need steriliseeritud krüoviaalidesse, laske neil mõni minut seista ning märkige rakutüüp ja külmsäilitamise kuupäev. 4 kraadi 30 minutit, -20 kraadi 30 minutit, -80 kraadi üleöö ja seejärel asetada vedelasse lämmastikku ladustamiseks. Krüosäilituslahuse valmistamine: 70 protsenti täissöödet pluss 20 protsenti FBS-i pluss 10 protsenti DMSO-d. DMSO tuleks lisada aeglaselt tilkhaaval, loksutades samal ajal tilkudes.
